Knowl. Managt. Aquatic Ecosyst. (2009) 393, 01

Review on the acute Daphnia magna toxicity test – Evaluation of the sensitivity and the precision of assays performed with organisms from laboratory cultures or hatched from dormant eggs

Revue de l’essai aigu de toxicité vis-à-vis de Daphnia magna – Évaluation de la sensibilité et de la précision des résultats obtenus à partir d’organismes provenant d’élevages de laboratoires ou d’organismes éclos d’œufs de dormance

¹ Ghent University, Laboratory for Environmental Toxicology and Aquatic Ecology, Ghent, Belgium
² MicroBioTests inc., Mariakerke, Belgium
³ CNR – Istituto per lo Studio degli Ecosistemi, Verbania, Pallanza, Italy
⁴ National Institute of Chemistry, Laboratory for Environmental Science and Engineering, Ljubljana, Slovenia
⁵ Fluvial Ecosystems Research, Aquatic Ecosystem Protection Research Division, Water Science and Technology Directorate, Environment Canada, Montreal, Canada
⁶ ALcontrol Laboratories, Rotherham, England
⁷ MAR-CMA – Instituto do Mar, Department of Zoology, University of Coimbra, Coimbra, Portugal
⁸ Cemagref, Laboratoire d’Écotoxicologie, Lyon, France
⁹ National Institute of Environmental Health, Department of Hygiene, Water Biology and Ecotoxicology, Budapest, Hungary
¹⁰ University of Incheon, Department of Biology, Incheon, South Korea

Corresponding author: Guido.persoone@ugent.be

Received: 13 May 2009
Accepted: 26 June 2009

Abstract

Executive summary : One of the most internationally used bioassays for toxicity screening of chemicals and for toxicity monitoring of effluents and contaminated waters is the acute toxicity test with daphnid crustaceans, and in particular that performed with Daphnia magna.

Standard methods have been developed for this assay that were gradually endorsed by national and international organisations dealing with toxicity testing procedures, in view of its application within a regulatory framework. As for all toxicity tests, the organisms used for the acute D. magna assay have to be obtained from live stocks which are cultured in the laboratory on live food (micro-algae).

Unsurprisingly the various standard protocols of this particular assay differ – at least to a certain extent – with regard to the test organism culturing conditions. In addition, some technical aspects of the toxicity test such as the effect criterion (mortality of immobility), the exposure time, the type of dilution water, etc., also vary from one standard to another.

Although this particular assay is currently used in many countries, the technical and biological problems inherent in year-round culturing and availability of the biological material and the culturing/maintenance costs of live stocks restrict its application to a limited number of highly specialised laboratories.

This fundamental bottleneck in toxicity testing triggered investigations which brought forward the concept of “microbiotests” or “small-scale” toxicity tests. “Culture/maintenance free” aquatic microbiotests with species of different phylogenetic groups were developed in the early 1990s at the Laboratory for Environmental Toxicology and Aquatic Ecology at the Ghent University in Belgium.

These assays which were given the generic name “Toxkits”, are unique in that they employ dormant stages (“cryptobiotic eggs”) of the test species, which can be stored for long periods of time and “hatched” at the time of performance of the assays.

One of these microbiotests is the Daphtoxkit F magna, which is currently used in many laboratories worldwide for research as well as for toxicity monitoring purposes.

The microbiotest technology has several advantages in comparison to the “traditional” tests based on laboratory cultures, especially its independence of the stock culturing burden. However, the acceptance (or possible non-acceptance) of performing assays with test organisms obtained from “dormant eggs” should be clearly dictated by the “sensitivity” and “precision” criteria of the former assays in comparison to the latter.

The first part of this review therefore thoroughly reviews the scientific literature and of data obtained from various laboratories for assays performed with either D. magna test organisms obtained from lab cultures or hatched from dormant eggs.

Attention has focused on data of quality control tests performed on reference chemicals, and in particular on potassium dichromate (K₂Cr₂O₇) for which an acceptability range of 0.6–2.1 mg·L^–1 has been set in ISO standard 6341 for the 24 h EC50 of the acute D. magna assay.

Mean EC50s, standard deviations and variation coefficients were calculated from the collected data, all of which are presented in tables and figures and discussed in detail.

The major conclusions drawn from the analysis of the large number of quality control (QC) data on the acute D. magna toxicity test are that :

(1) Virtually all results from assays performed with Daphnias taken from lab cultures or with Daphnia microbiotests are within the acceptability range set by ISO standard 6341 for the reference chemical potassium dichromate.

(2) The mean 24 h EC50s of the Daphnia microbiotests performed in different laboratories are within the range of the mean EC50s of the assays based on lab cultures, and the variation coefficients (20 to 30%) are similar.

(3) The precision – in terms of the long term in house variability – of the quality control Daphnia microbiotests is as good as that of the QC tests based on lab cultures.

The review further reports on intra-laboratory sensitivity comparison studies performed during the last 15 years on pure chemicals and on natural samples, with both laboratory cultured organisms and Daphnias hatched from dormant eggs. These studies carried out in different laboratories showed EC50 correlation coefficients of 0.86 to 0.98, corroborating a similar sensitivity of the two types of test organisms.

The third part of the review reports and analyses data on proficiency ringtests on the acute D. magna assay which have been organised in different countries since 2002 with either reference chemicals or with natural samples, and in which part of the laboratories performed their assays with Daphnia microbiotests and others with lab cultured Daphnias.

The conclusions drawn from all the ringtests indicate that the sensitivity of Daphnia neonates hatched from dormant eggs is similar to that of test organisms taken from lab cultures and that in most cases the precision of the Daphnia microbiotest is superior to that of the assays based on lab cultures.

The review finally addresses the issue of possible sensitivity differences of Daphnias hatched from dormant eggs which are produced by different D. magna strains.

From these investigations it appeared that the EC50s from assays performed with Daphnias hatched from dormant eggs of different strains did not differ significantly from those from assays undertaken with daphnids from lab cultures.

The obvious advantages of Daphnia microbiotests over tests with Daphnias stemming from lab cultures have led to the worldwide use of these culture/maintenance free and low cost small-scale assays in both research and toxicity monitoring.

The Daphnia microbiotest is in current use in several countries for toxicity testing in a regulatory framework, and recent calculations indicate that about 10 000 acute D. magna assays are now performed annually with neonates hatched from dormant eggs.

The use of dormant eggs to obtain test organisms independently of stock culturing has recently also been accepted in international standards for toxicity testing. ISO standard 20665 (2008) related to the determination of chronic toxicity with Ceriodaphnia dubia, and ISO standard 20666 (2008) for the determination of the chronic toxicity with Brachionus calyciflorus in 48 h, both indicate that the assays can be conducted with organisms hatched from dormant eggs.

On the basis of the extensive scientific evidence provided in this review that is justifiably supported by the two ISO methods mentioned above, the authors therefore recommend that the use of Daphnias hatched from dormant eggs should also be incorporated in national and international standards, as an alternative to the use of Daphnias taken from laboratory cultures.

Résumé

Résumé étendu : L’essai de toxicité aigu vis-à-vis de daphnies, en particulier celui entrepris avec Daphnia magna, est l’un des plus populaires utilisés au niveau international pour le dépistage de la toxicité de produits chimiques et la surveillance d’effluents et d’eaux contaminées.

Avec le temps, des méthodes normalisées développées avec cet essai ont été reconnues par des organismes nationaux et internationaux intéressés par les tests biologiques, en vue de son application dans un contexte réglementaire.

À l’instar des autres tests biologiques, les organismes intervenant dans l’essai aigu avec D. magna proviennent d’élevages de laboratoires nourris de micro-algues. Il n’est pas surprenant de constater que les différentes procédures standard varient jusqu’à un certain point en ce qui a trait aux conditions d’élevage des animaux tests.

Par ailleurs, pour cet essai il ne semble pas non plus exister de constance sur certains aspects techniques liés par exemple au paramètre de toxicité (létalité ou immobilité), au temps d’exposition, à la composition de l’eau de dilution, lesquels peuvent varier de façon marquée.

Bien que cet essai soit maintenant conduit dans beaucoup de pays, les contraintes techniques et biologiques associées à l’élevage des organismes, ainsi qu’à leur disponibilité continuelle, restreignent « de facto » son application à un nombre limité de laboratoires spécialisés.

Ce problème, critique pour l’entreprise de tests de toxicité, a promu des études qui ont abouti à des essais « à petite échelle », connus maintenant sous l’appellation de « microbiotests ».

De tels microbiotests, indépendants de tout souci d’élevage et d’entretien, ont été développés au début des années 1990 avec des organismes de différents groupes phylogéniques, au Laboratoire de Toxicologie environmentale et d’Écologie aquatique de l’Université de Gand en Belgique.

Baptisés « Toxkits », ces essais s’avèrent uniques par leur emploi de stades d’œufs de dormance (œufs cryptobiotiques) pour chaque espèce d’organisme concernée, ce qui permet au matériel biologique « au stade inerte » d’être entreposé durant de longues périodes et éclos au moment du démarrage d’un test de toxicité.

L’un de ces microbiotests est le Daphtoxkit F magna, présentement en usage à l’échelle mondiale pour des besoins de recherche ou de surveillance de toxicité. La technologie des microbiotests offre plusieurs avantages sur celle des essais traditionnels puisqu’elle assure l’indépendance du besoin d’élevage et de maintien de stocks des organismes tests.

Cependant, la reconnaissance par la communauté scientifique de la conduite d’essais avec des organismes éclos d’œufs de dormance passe obligatoirement par une preuve de sensibilité et de précision équivalente à celle de l’essai traditionnel.

La première partie de cette revue rappelle les principales études et résultats obtenus par divers laboratoires avec des organismes provenant d’élevages en laboratoire, et de daphnies éclos d’œufs de dormance.

Des données de contrôle de qualité entrepris avec des produits chimiques de référence, notamment le bichromate de potassium (K₂Cr₂O₇), ont été collectées, pour lequel une fourchette de CE50-24 h variant entre 0,6–2,1 mg·L^–1 est une condition d’acceptation pour l’essai aigu de D. magna selon la norme ISO 6341.

Les moyennes des CE50s, ainsi que leurs écarts-types et coefficients de variation sont rapportées et discutées en détail, avec tableaux et figures à l’appui.

À partir de l’analyse des nombreuses données portant sur le contrôle de qualité du test aigu de D. magna, il est possible de conclure que :

(1) Quasiment tous les essais effectués avec les daphnies provenant de cultures de laboratoire ou de microbiotests Daphnia sont conformes à la norme ISO 6341 pour ce qui est des résultats générés avec le bichromate de potassium.

(2) Les moyennes de CE50-24 h rapportées pour le microbiotest Daphnia par différents laboratoires sont dans la fourchette des résultats de l’essai traditionnel et les coefficients de variation (entre 20–30 %) sont semblables.

(3) La précision des tests de contrôle de qualité – qui témoigne de la variabilité sur une échelle de temps relativement longue pour chaque laboratoire – est équivalente pour les deux méthodes.

La revue, par la suite, fait état des études de comparaison de sensibilité intra-laboratoire réalisées avec les deux méthodes (traditionnelle et microbiotest) depuis 15 ans pour l’évaluation de produits chimiques et d’échantillons environnementaux. Provenant de laboratoires indépendants, les données démontrent des coefficients de corrélation situés entre 0,86 et 0,98, ce qui confirme la sensibilité équivalente des tests avec animaux d’élevage et ceux provenant des œufs de durée de D. magna.

La troisième partie de la revue offre un constat de l’analyse des données de tests d’intercalibration lancés depuis 2002 par différents pays avec le test aigu D. magna et dans lesquels certains laboratoires ont effectué leurs essais avec des organismes d’élevage et d’autres avec le microbiotest Daphnia.

Les conclusions émanant des tests d’intercalibration confirment que la sensibilité des daphnies issues d’œufs de dormance est comparable à celle des animaux d’élevage et que dans la plupart des cas, la précision du microbiotest Daphnia est même supérieure à celle des essais réalisés en conditions d’élevage.

Enfin, la revue discute des différences possibles de sensibilité de daphnies d’œufs de dormance provenant de souches différentes de D. magna.

De ces études, il apparaît qu’aucune différence significative n’est démontrée entre les CE50s issues d’essais de daphnies éclos des œufs de dormance produits par des souches différentes de D. magna et celles mesurées avec des animaux d’élevage.

Les avantages incontestables de l’essai entrepris avec des daphnies d’œufs de dormance (qui exclut le maintien de cultures) sur celui faisant appel aux animaux d’élevage, ont contribué à l’emploi international du microbiotest Daphnia à des fins de recherche et de surveillance.

Présentement employé dans plusieurs pays tant à des fins de réglementation de la toxicité que de recherches en écotoxicologie, il est estimé que quelque 10 000 essais aigus vis-à-vis de D. magna sont entrepris sur une base annuelle avec le microbiotest Daphnia.

L’emploi d’œufs de dormance a déjà été reconnu par des instances normatives internationales à des fins d’études de toxicité.

La norme ISO 20665 de 2008 décrivant l’essai de toxicité chronique vis-à-vis de Ceriodaphnia dubia, par exemple, ainsi que la norme ISO 20666 de 2008 décrivant celui de 48 h conduit avec Brachionus calyciflorus précisent que ces tests peuvent être appliqués avec des organismes éclos d’œufs cryptobiotiques.

À la lumière de l’envergure des données scientifiques validées et rapportées dans cette revue, lesquelles sont logiquement appuyées par les normes ISO mentionnées ci-dessus, les auteurs s’accordent unanimement à recommander l’emploi de daphnies provenant d’œufs de dormance pour l’entreprise d’essais normatifs nationaux et internationaux au même titre que les daphnies provenant d’élevage en laboratoire.